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Accueil du site || Maladie et impacts || Diagnostic de laboratoire || Intérêt des outils moléculaires dans le diagnostic

Des techniques moléculaires (RT-PCR [1]) ont été développées au cours de ces dernières années.

Elles permettent d’amplifier l’ARN génomique viral à partir d’échantillons cliniques (sang notamment).

Le génome du virus de la fièvre catarrhale est composé de 10 segments d’ARN double-brin de différentes tailles. Certains de ces segments sont communs aux différents sérotypes viraux (conservés) ; d’autres sont au contraire variables selon les virus.

Développement des outils moléculaires

-  Séquençage et sélection d’amorces

Le séquençage des segments d’ARN composant le génome viral permet de sélectionner les amorces employées par la suite dans les tests PCR.

  • Les amorces dérivées des segments conservés , tels que ceux codants les protéines de capside VP3, VP6 (segment 6), VP7 (segment 7) ou la protéine non structurale NS1, peuvent être utilisées pour réaliser un diagnostic de groupe : détection du génome des virus de la fièvre catarrhale et/ou de l’EHD (maladie épizootique hémorragique des cervidés).
  • Les amorces dérivées des segments variables , tels que ceux codants la protéine de surface externe VP2 (segment 2) ou la protéine non structurale NS3 (segment 10), fournissent des informations sur le sérotype : mise au point de tests de typage différentiel (distinction des infections imputables aux virus de sérotypes 1, 6, 8).

-  Mise au point de trousses de diagnostic et de typage

Des trousses de RT-PCR en temps réel ont ainsi été mises au point et validées par le laboratoire national de référence en collaboration avec des sociétés privées (AES chemunex et LSI). Elles sont actuellement utilisées en routine (liste disponible sur le site internet du ministère de l’agriculture et de la pêche) :

  • Kits de RT-qPCR duplex permettant le diagnostic :
    • du groupe de la FCO,
    • du génotype 1 de la FCO,
    • du génotype 8 de la FCO,
  • Kits de RT-qPCR triplex permettant le diagnostic :
    • du groupe de la FCO et du génotype 1 de la FCO,
    • du groupe de la FCO et du génotype 8 de la FCO.

Ces différents kits permettent la détection :

  • de l’ARN du virus de la Bluetongue (détection des 24 génotypes recensés),
  • et/ou d’une séquence spécifique du génotype (1 ou 8),
  • et d’un IPC (contrôle positif interne endogène) permettant de contrôler l’efficacité de la purification de l’ARN et l’absence d’inhibiteurs dans l’échantillon.

Les informations techniques relatives à ces kits sont disponibles auprès de l’AFSSA-LERPAZ.

-  Décentralisation du diagnostic moléculaire

Un essai inter-laboratoire d’aptitude a été organisé par le laboratoire national de référence de l’AFSSA en 2008.

A la suite de cet essai, a pu être constitué un réseau de 60 laboratoires vétérinaires départementaux agréés pour réaliser le diagnostic virologique et le génotypage 1/8.

(Voir à ce sujet la Note de service DGAL/SDPPST/N2009-8143 du 20 mai 2009 définissant la liste des laboratoires agréés).

Virémie et positivité du test PCR : deux notions distinctes

- Chez un animal infecté, le virus est, en moyenne, décelable au niveau sanguin (virémie) de 5-6 jours jusqu’à 20-30 jours post-infection ; dans certains cas, la virémie peut néanmoins durer jusqu’à 60 jours post-infection (8 semaines maximum).

Il existe quelques différences selon les espèces. Ainsi, la virémie est-elle plus importante et plus précoce chez les ovins que chez les caprins.

- Les tests PCR permettent de détecter des copies du génome viral sur une période s’étendant de 1 à 2 jours jusqu’à 6-7 mois (200 jours) après le début d’une infection (ce maximum est rarement obtenu). L’identification du génome viral témoigne uniquement d’un contact récent de l’animal avec le virus. Elle ne signifie pas que le virus est en phase de multiplication ni que l’animal est toujours virémique.

  • Ainsi, en règle générale, le résultat du test PCR est positif lorsque l’isolement viral est positif. C’est le plus souvent le cas en début d’infection lorsque la quantité de virus présente dans le sang (charge virale) est élevée.
  • Un résultat de PCR positif peut fréquemment être obtenu sans isolement de virus. Un animal dont le test PCR est positif n’est pas obligatoirement considéré comme un animal « à risque » si la charge virale est faible.

Quantification et datation de l’infection

L’intensité de la réponse du test d’amplification génomique (ou CT pour « cycle threshold » ou seuil de cycles) apporte une information quantitative sur la présence de génome viral. La valeur du CT est inversement proportionnelle à la quantité d’ARN initial.

En estimant le nombre de copies de génome viral par PCR, on cherche à apprécier la charge virale ce qui renseigne aussi sur l’ancienneté de l’infection :

  • Un grand nombre de copies (valeur du CT faible) signe une infection récente (virémie habituellement élevée) ;
  • Un nombre faible de copies (valeur du CT élevée) caractérise une infection soit très récente, soit au contraire ancienne (augmentation du CT dans les semaines qui suivent l’infection, lorsque la virémie décline).

Pendant les premiers mois de l’année civile (et au moins un mois après le début de l’inactivité vectorielle), la valeur du CT a été considérée pour identifier les cas résultant d’une reprise de la circulation virale :

  • CT supérieur à 28 : contamination ancienne, a priori attribuable à une contamination survenue lors de l’année précédente,
  • CT inférieur ou égal à 28 : valeur compatible avec une virémie récente et une reprise de la circulation du virus.

Après la constatation de la reprise de la circulation d’un sérotype donné, la datation des cas perd de son intérêt.
Ainsi, au regard de l’évolution de l’épizootie au cours du premier semestre de 2009, l’AFSSA a-t’elle considéré comme désormais inutile le recours au seuil de CT (avis du 3 juillet 2009 repris dans la note de service DGAL/SDSPA/N2009-8195.

Du diagnostic à l’épidémiologie

L’analyse des séquences d’ARN génomique (segments 2 et 10 en particulier) permet l’étude et la comparaison des souches virales.

Ainsi, au-delà des applications diagnostiques abordées ci-dessus, les outils moléculaires apportent ils aussi des informations précieuses sur l’origine et la progression des épizooties.


Pour en savoir plus :

- Ci dessous : Diaporama présenté par S. Zientara (AFSSA) sur le "Typage moléculaire du virus de la fièvre catarrhale ovine (BTV)" au cours de la journée d’information et d’échanges sur la fièvre catarrhale ovine organisée par le Réseau Français pour la Santé Animale le 21 janvier 2009.

- Synthèse réalisée par S. Zientara (UMR Afssa/INRA/ENVA) concernant l’"Etude de la virémie chez les caprins et les ovins pour le sérotype 8"

- Origine des nouveaux sérotypes de fièvre catarrhale présents en Europe du Nord : l’apport des études de typage moléculaire

- Isolement et identification du virus

- Diagnostic sérologique

notes:

[1] RT-PCR : transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase

Pièces jointes